堿性磷酸酶（AKP/ALP）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書

                                                   微量法100T/48S

注   意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：                           

AKP/ALP是一種含鋅的糖蛋白酶，在堿性環(huán)境中可水解各種天然及人工合成的磷脂單酯化合物。AKP/ALP廣泛分布于人體各臟器中，以肝臟為主。

測(cè)定原理：

在堿性環(huán)境中，AKP/ALP催化磷酸苯二鈉生成游離酚；酚與4-氨基安替/比林和鐵氰hua鉀反應(yīng)紅色亞醌衍生物，在510nm有特征光吸收；通過(guò)測(cè)定510 nm吸光度增加速率，來(lái)計(jì)算AKP活性。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體×1瓶，4℃避光保存。

試劑三：液體×1瓶，4℃避光保存。

試劑四：液體×1瓶，4℃避光保存，未變成藍(lán)綠色之前均可使用。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1支（EP管中），2 μmol/mL酚標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿，4℃、8000g離心10min，取上清液待測(cè)。

2.        細(xì)菌或細(xì)胞：按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3.        血液可直接測(cè)定，或者適當(dāng)稀釋后測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到510 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑三置于37℃水浴中預(yù)熱30 min。

3. 空白管：取EP管，加入4μL蒸餾水，40μL試劑二，40μL試劑三，混勻后置于37℃水浴中保溫15min；加入試劑四120μL，混勻后于510nm測(cè)定吸光度，記為A空白管。

4. 標(biāo)準(zhǔn)管：取EP管，加入4μL標(biāo)準(zhǔn)品，40μL試劑二，40μL試劑三，混勻后置于37℃水浴中保溫15min；加入試劑四120μL，混勻后于510nm測(cè)定吸光度，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

5. 對(duì)照管：取EP管，加入4μL上清液，40μL蒸餾水，40μL試劑三，混勻后置于37℃水浴中保溫15min；加入試劑四120μL，混勻后于510nm測(cè)定吸光度，記為A測(cè)定管。

6. 測(cè)定管：取EP管，加入4μL上清液，40μL試劑二，40μL試劑三，混勻后置于37℃水浴中保溫15min；

加入試劑四120μL，混勻后于510nm測(cè)定吸光度，記為A測(cè)定管。

其中標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只需做一管，測(cè)定管和對(duì)照管每個(gè)樣均需做。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。

AKP/ALP活性計(jì)算：

1.        血液中AKP/ALP活力計(jì)算

活性單位定義：37℃中每毫升血液每分鐘催化產(chǎn)生1μmol酚定義為1個(gè)酶活單位。

AKP/ALP活力(μmol/min /mL)= [C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總] ÷V樣÷T=6.8×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)

2.        組織、細(xì)菌或細(xì)胞中AKP/ALP活性計(jì)算

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 μ mol酚定義為1個(gè)酶活單位。

AKP/ALP(μmol/min/mg prot)=[C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總]÷(Cpr×V樣)÷T=6.8×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：37℃中每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1 μ mol酚定義為1個(gè)酶活單位。

AKP/ALP(μmol/min/g 鮮重)=[C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=6.8×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ÷W

（3）按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：37℃中每10⁴個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 μ mol酚定義為1個(gè)酶活單位。AKP/ALP (μmol/min/10⁴ cell)= [C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總]÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T= 6.8×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量

C標(biāo)準(zhǔn)品：2μmol/mL；V反總：反應(yīng)體系總體積（mL），205μL=0.205mL； Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定，建議使用本公司生產(chǎn)的BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），0.004mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），15 min。

注意事項(xiàng)：

1.試劑二、試劑三和試劑四均需避光保存。

2.試劑四變藍(lán)綠色后不能再使用。

3.加入試劑四后必須立即混勻，否則顯色不wan全。

堿性磷酸酶（AKP/ALP）活性測(cè)定試劑盒僅供科研！