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豬細(xì)小病毒(PPV)核酸檢測(cè)試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2024/11/25      點(diǎn)擊次數(shù):380

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱:豬細(xì)小病毒(PPV)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光 PCR 法)

Name :Porcine Parvovirus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus, PPV)是引起母豬流產(chǎn)和新生仔豬死亡的主要病原體之一,同時(shí)也能引起某些皮膚病和腹瀉。本試劑盒適用于檢測(cè)可疑豬組織器官、死胎及公豬精液等樣本中的豬細(xì)小病毒,用于豬細(xì)小病毒感染的輔助診斷。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實(shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù),設(shè)計(jì)一對(duì)豬細(xì)小病毒特異性引物,結(jié)合一條特異性探針, 用熒光 PCR 技術(shù)對(duì)豬細(xì)小病毒的 DNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè),用于科研上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)檢測(cè)。

【試劑組成】

包裝規(guī)格50T/盒

PPV 反應(yīng)液500μL×2 管

酶液50μL×1 管

PPV 陽(yáng)性質(zhì)控品50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管

說明:不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次,有效期 12 個(gè)月。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。

【標(biāo)本采集】

取可疑豬組織器官、死胎,或公豬精液;

【保存和運(yùn)輸】

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h;若需長(zhǎng)期保存,應(yīng)放置-70℃以下保存,凍融不超過 3 次。

【使用方法】

1.樣品處理(樣本處理區(qū))

1.1樣本前處理

組織樣品:取可疑豬組織器官、死胎等 1g,研磨,加入 4mL 的樣品裂解液懸浮,凍融 3 次,5000r/min 離心 5min 取上清液?;?qū)⒔M織磨碎后,加入 4mL 含 10%小牛血清的 Hanks 液,凍融 3 次,5000r/min 離心 5min, 取上清備用。

公豬精液:采集 2mL 公豬精液,凍融 3 次備用。其他樣品前處理可參考 SN/T 1919-2016 [3]。

1.2核酸提取

推薦采用優(yōu)利科(上海)生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的   核酸提取試劑盒(離心柱法)進(jìn)行核酸提取,請(qǐng)按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))

根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù),設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照;反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份,多配制 1 份),每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表:

試劑PPV 反應(yīng)液酶液

用量(樣本數(shù)為 N)19μL1μL

將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,20μL/管。

3.加樣(樣本處理區(qū))

將步驟 1 提取的核酸、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。

4.PCR 擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))

4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi);

4.2設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL;

熒光通道選擇: 檢測(cè)通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇

ROX 參比熒光,選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:

步驟循環(huán)數(shù)溫度時(shí)間收集熒光信號(hào)

11 cycle95℃2min

245 cycles95℃15sec

60℃30sec

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定(請(qǐng)參照各儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置,以分析 ABI7500 儀器為例)

反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)保存結(jié)果,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值(用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整,Start 值可設(shè)在 3~15、End 值可設(shè)在 5~20,使閾值線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)期,陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線),點(diǎn)擊 Analyze 自動(dòng)獲得分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽(yáng)性:檢測(cè)通道 Ct 值≤40,且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線; 陰性:樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>40 或無 Ct 值。

5.3質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品:無特異性擴(kuò)增曲線或無 Ct 值;

陽(yáng)性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期,且Ct 值≤32; 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足,否則實(shí)驗(yàn)視為無效。

6.檢測(cè)方法的局限性

1.樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān);

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果;

3.陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果;

4.病原體在流行過程中基因突變、重組,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

5.不同的提取方法存在提取效率差異,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

6.試劑運(yùn)輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果;

7.本檢測(cè)結(jié)果僅供參考,如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。

【注意事項(xiàng)】

1.所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行;

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,完-全混勻并短暫離心;

3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存;

4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服;

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,以免交叉污染;

7.實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器;

8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Mengeling W L. Prevalence of porcine parvovirus induced reproductive; an abattoir study [J]. Am Vet Med Assoc, 1978, 172: 1291-1294.

[2]Den S. Parvovirus-like particle associated with diarrhea in unweaned piglets [J]. Can Comp Med, 1985, 49: 343-345.

[3]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. SN/T 1919-2016 豬細(xì)小病毒病檢疫技術(shù)規(guī)范[S].


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