過氧化物酶(Peroxidase，POD)試劑盒說明書

                                          微量法100管/96樣

注   意 ：正式測定前務(wù)必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

POD（EC 1.11.1.7）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。

測定原理：

POD催化H₂O₂氧化特定底物，在470nm有特征光吸收。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水

試劑的組成：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體25mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：液體100μL×1支，4℃保存；

試劑三：液體100μL×1支，4℃保存。

粗酶液提取：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、   分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至470nm，蒸餾水調(diào)零。

2、   工作液的配制：臨用前將試劑一、試劑二、試劑三按照2.6（mL）：1.5（μL）：1（μL）的比例混勻；在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）預熱10min以上；現(xiàn)配現(xiàn)用。

3、   在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL工作液，混勻，記錄470nm下1min時吸光值A1和2min后的吸光值A2。計算ΔA＝A2-A1。

注意：

如果ΔA小于0.005，可將反應(yīng)時間延長到5min。如果ΔA大于0.5，可將樣本用提取液稀釋后測定，計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

POD活性計算：

用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）POD活性

單位定義：每mL血清（漿）在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.01為一個酶活力單位。

計算公式：

POD（U/mL）=ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T =2000×ΔA

2、組織、細菌或細胞POD活性

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.01為一個酶活力單位。

POD（U/mg prot）＝ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.01÷T =2000×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.01為一個酶活力單位。

POD（U/g 鮮重）＝ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T =2000×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位定義：每1萬個細菌或細胞在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.01為一個酶活力單位。

POD（U/10⁴ cell）＝ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T =4×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL； V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。

用96孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）POD活性

單位定義：每mL血清（漿）在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.005為一個酶活力單位。

POD（U/mL）=ΔA×V反總÷V樣÷0.005÷T =4000×ΔA

2、組織、細菌或細胞POD活性

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.005為一個酶活力單位。

POD（U/mg prot）＝ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.005÷T =4000×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.005為一個酶活力單位。

POD（U/g 鮮重）＝ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.005÷T =4000×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位定義：每1萬個細菌或細胞在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.005為一個酶活力單位。

POD（U/10⁴ cell）＝ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.005÷T =8×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL； V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。