糖原磷酸化酶b（Glycogen phosphorylase b，GPb）試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                            微量法100管/48樣

注   意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

糖原磷酸化酶（Glycogen phosphorylase，GP，EC 2.4.1.1)）是糖原分解代謝的關(guān)鍵酶，使糖原分子從非還原端逐個(gè)斷開(kāi)α-1，4-糖苷鍵移去葡萄糖基，釋放1-磷酸葡萄糖，直至臨近糖原分子α-1，6-糖苷鍵分支點(diǎn)前4個(gè)葡萄糖基處。GP分為有活性的糖原磷酸化酶a（GPa）和無(wú)活性的糖原磷酸化酶b（GPb）兩種形式。GPb在一定濃度的腺苷酸（5^，-AMP）存在下可被激活。

測(cè)定原理：

GP催化糖原和無(wú)機(jī)磷產(chǎn)生葡萄糖殘基生成糖原和1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步依次催化NADP還原生成NADPH，在340nm下測(cè)定NADPH上升速率，即可反映GP活性。添加一定濃度的腺苷酸（5^，-AMP）時(shí)測(cè)定GP（GPa和GPb）活性，未添加腺苷酸（5^，-AMP）時(shí)測(cè)定GPa活性，GP活性－GPa活性得到GPb活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體16 mL×1瓶， 4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存；

試劑三：粉劑×1支，-20℃保存；

試劑四：粉劑×1支， -20℃保存；

試劑五：粉劑×1支， -20℃保存；

樣本的前處理：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零；

2、  工作液的配制：臨用前將試劑二轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

3、  試劑三的配制：臨用前在試劑三瓶中加入1mL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

4、  試劑四的配制：臨用前在試劑四瓶中加入1mL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

5、   試劑五的配制：臨用前在試劑五管中加入500μL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保

6、   存，禁止反復(fù)凍融。

7、   將工作液、試劑三、試劑四和試劑五置于37℃預(yù)熱5分鐘；

8、   在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑三、10μL試劑四、10μL蒸餾水和160μL工作液，立即混勻，記錄340nm處5min后的A1和10min后的吸光值A2，計(jì)算ΔAGPa=A2-A1。

9、   在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑三、10μL試劑四、10μL試劑五和160μL工作液，立即混勻，記錄340nm處5min后的A3和10min后的吸光值A4，計(jì)算ΔAGP=A4-A3。

注意：由于每個(gè)樣本需要同時(shí)測(cè)一個(gè)GP（GPa和GPb）活性和一個(gè)GPa活性，因此本試劑盒100管測(cè)48個(gè)樣本。

GPb活性計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

GPb（nmol/min/mg prot）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×(ΔAGP－ΔAGPa)÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

GPb（nmol/min/g 鮮重）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=643×(ΔAGP－ΔAGPa)÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

GPb（nmol/min/mg prot）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1286×(ΔAGP－ΔAGPa)÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

GPb（nmol/min/g 鮮重）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=1286×(ΔAGP－ΔAGPa)÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。