蔗糖合成酶（合成方向；SS-Ⅱ）試劑盒說明書

                                   微量法100管/48樣

注   意 ：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

蔗糖是源（葉片等）光合產(chǎn)物向“庫"器官運輸?shù)闹饕螒B(tài)。蔗糖合成酶（Sucrose Synthase, EC 2.4.1.13）是雙向反應(yīng)酶，既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解，是蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一。研究其合成方向SS-Ⅱ的活性對于植物蔗糖合成具有重要意義。

測定原理：

SS-Ⅱ催化游離果糖與葡萄糖供體UDPG反應(yīng)生成蔗糖，蔗糖與間苯二酚反應(yīng)可呈現(xiàn)顏色變化，在480nm下有特征吸收峰，酶活力大小與顏色的深淺成正比。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋、離心機(jī)、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰

試劑的組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體2.5mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：1000μg/mL蔗糖溶液10mL×1瓶，4℃保存；

試劑三：液體2mL×1瓶，4℃保存

試劑四：液體25mL×1瓶，4℃保存；

試劑五：液體6mL×1瓶，4℃避光保存；

樣品測定的準(zhǔn)備：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、   分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至480nm，蒸餾水調(diào)零。

2、   樣本測定，（在EP管中依次加入下列試劑）：

混勻，25℃準(zhǔn)確水浴10min

沸水浴中煮沸10min左右（蓋緊，以防止水分散失），冷卻

混勻，沸水浴30min，冷卻后，取200μL 至微量石英比色皿或96孔板中，480nm下測定各管吸光值。標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只要做一管。每個測定管需要設(shè)一個對照管。

SS-Ⅱ活性計算：

1、按照蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg 蔗糖定義為一個酶活力單位。

SS-Ⅱ活性(μg /min/mg prot)= C標(biāo)準(zhǔn)管×V1×（A測定管-A對照管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷(V1×Cpr)÷T=100×（A測定管-A對照管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr

2、按照樣本鮮重計算

單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg 蔗糖定義為一個酶活力單位。

SS-Ⅱ活性(μg /min/g鮮重) = C標(biāo)準(zhǔn)管×V1×（A測定管-A對照管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷(W×V1÷V2)÷T=100×（A測定管-A對照管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W

C標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，1000μg/mL；V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL； V2：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；T ：反應(yīng)時間：10min。