天冬酰胺合成酶(asparagine synthetase，AS) 活性測定試劑盒說明書

                                      微量法100管/96樣

注    意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

天冬酰胺合成酶是廣泛存在于生物體內(nèi)的一類氨基轉(zhuǎn)移酶，催化谷氨酞胺的氨基向天冬氨酸轉(zhuǎn)移。當植物處于氨毒時天冬酞胺的形成是一種解毒反應。

測定原理：

AS催化L-天冬酰胺水解成L-天冬氨酸和氨，利用奈氏試劑檢測氨增加的速率，即可計算其酶活性。

需自備儀器和用品：

臺式離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽、冰和雙蒸水。

試劑組成和配制：

試劑一×2瓶，60 mL，4 ℃保存；

試劑二×1瓶，40 mL，4 ℃保存；

試劑三×1瓶，60 mL，常溫保存；

試劑四×1瓶，5 mL，常溫保存；

試劑五×1瓶，3 mL，常溫保存；

試劑六×1瓶，3 mL，常溫避光保存。

粗酶液提?。?/span>

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至420nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣品測定（在EP管中加入下列試劑）：

混勻，37℃水浴1 小時

混勻，8000 g，25℃離心10 min；取上清液，在EP管或96孔板中加入下列試劑

混勻，室溫靜置15min，420nm處讀取測定管和對照管吸光值，計算ΔA=A測定管-A對照管。對照管只要做一管。

注意：試劑六如出現(xiàn)沉淀，靜置后取上清使用。

酶活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準條件下測定的回歸方程為y = 0.662x -0.0434；x為標準品濃度（μg/mL），y為吸光值A。

1、血清（漿）AS活性

單位定義：每mL血清（漿）每小時產(chǎn)生1μg 氨定義為一個酶活力單位。

AS（μg/h/mL）＝(ΔA+0.0434) ÷0.662×V反總÷V樣÷T=31.722×(ΔA+0.0434)

2、組織、細菌或細胞中AS活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每小時產(chǎn)生1μg 氨定義為一個酶活力單位。

AS活力（μg/h/mg prot）＝(ΔA+0.0434) ÷0.662×V反總÷(V樣×Cpr)÷T =31.722×(ΔA+0.0434) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每小時產(chǎn)生1μg氨定義為一個酶活力單位。

AS活力（μg/h/g 鮮重）＝(ΔA+0.0434) ÷0.662×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷T =31.722×(ΔA +0.0434) ÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每小時產(chǎn)生1μg 氨定義為一個酶活力單位。

AS活力（μg/h/10⁴ cell）＝(ΔA+0.0434) ÷0.662×V反總÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.0634×(ΔA+0.0434)

T：反應時間，1h； V反總：反應體系總體積：0.525mL；V樣：加入反應體系中樣本體積，0.025mL；V樣總：提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量， g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬

b.用96孔板測定的計算公式如下

標準條件下測定的回歸方程為y = 0.3046x -0.0097；x為標準品濃度（μg/mL），y為吸光值A。

1、血清（漿）AS活力的計算:

單位的定義：每mL血清（漿）每小時產(chǎn)生1μg 氨定義為一個酶活力單位。

AS活力（μg/h/mL）＝(ΔA +0.0097) ÷0.3046×V反總÷V樣÷T=68.94×(ΔA +0.0097)

2、組織、細菌或細胞中AS活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每小時產(chǎn)生1μg 氨定義為一個酶活力單位。

AS活力（μg/h/mg prot）＝(ΔA +0.0097) ÷0.3046×V反總÷(V樣×Cpr)÷T =68.94×(ΔA +0.0097) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每小時產(chǎn)生1μg氨定義為一個酶活力單位。

AS活力（μg/h/g 鮮重）＝(ΔA +0.0097) ÷0.3046×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷T =68.94×(ΔA +0.0097）÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每小時產(chǎn)生1μg 氨定義為一個酶活力單位。

AS活力（μg/h/10⁴ cell）＝(ΔA+0.0097) ÷0.3046×V反總÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.1379×(ΔA +0.0097)

T：反應時間，1h； V反總：反應體系總體積：0.525mL；V樣：加入反應體系中樣本體積，0.025mL；V樣總：提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量， g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。