賴(lài)氨酸(lysine，Lys)含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                 微量法100管/96樣

注    意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

賴(lài)氨酸是人體必需氨基酸之一，能促進(jìn)人體發(fā)育、增強(qiáng)免疫功能，并有提高中樞神經(jīng)組織功能的作用。賴(lài)氨酸為堿性必需氨基酸。由于谷物食品中的賴(lài)氨酸含量甚低，且在加工過(guò)程中易被破壞而缺乏，故稱(chēng)為第一限制性氨基酸。

測(cè)定原理：

蛋白質(zhì)中的賴(lài)氨酸具有一個(gè)游離的ε-NH2，它與茚三酮試劑反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)，其顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與賴(lài)氨酸的含量成線(xiàn)性關(guān)系。亮氨酸與賴(lài)氨酸的碳原子數(shù)目相同，而且僅有—個(gè)游離氨基(ε-NH2)，所以通常用亮氨酸配制標(biāo)準(zhǔn)液。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水、水浴鍋。

試劑的組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入12.5mL試劑三充分溶解混勻；

試劑二：液體12.5mL×1瓶，4℃保存；

試劑三：液體15mL×1瓶，4℃保存；

試劑四：60%乙醇，自備。

賴(lài)氨酸提?。?/span>

樣本烘干粉碎，稱(chēng)取約0.01g樣本，加入1mL提取液，充分勻漿。80℃水浴提取20min，冷卻后10000g離心10min，取上清待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、   分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至570nm，蒸餾水調(diào)零。

2、   工作液的配制：取10mL試劑一與10mL試劑二混合搖勻，取上清備用。用不完的試劑4℃保存。

3、   在有蓋EP管中加入下列試劑：

混勻，80℃水浴30min（蓋緊，以防止水分散失），冷卻至常溫。

混勻，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中，于530nm波長(zhǎng)處記錄吸光值A。△A=A測(cè)定管-A空白管。

空白管只要做一管。

賴(lài)氨酸含量計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 0.0062x - 0.0212；x為賴(lài)氨酸含量（µg/mL），y為吸光值。

1.按照蛋白濃度計(jì)算

賴(lài)氨酸含量(µg/mg prot)=[(△A +0.0212)÷0.0062×V1]÷(Cpr ×V1)×1.1515

=185.73×(△A+0.0212) ÷Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計(jì)算

賴(lài)氨酸含量(µg/g干重)=[(△A +0.0212)÷0.0062×V1]÷(W ×V1÷V2)×1.1515

=185.73×(△A+0.0212) ÷W

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；V2：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；1.1515，校正系數(shù)。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 0.0031x - 0.0212；x為賴(lài)氨酸含量（µg/mL），y為吸光值。

1.按照蛋白濃度計(jì)算

賴(lài)氨酸含量(µg/mg prot)=[(△A +0.0212)÷0.0031×V1]÷(Cpr ×V1)×1.1515

=371.45×(△A+0.0212) ÷Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計(jì)算

賴(lài)氨酸含量(µg/g干重)= [(△A +0.0212)÷0.0031×V1]÷(W ×V1÷V2)×1.1515

=371.45×(△A+0.0212) ÷W

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；V2：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；1.1515，校正系數(shù)。